1. Виникнення та розвиток генетичної інженерії Технологія рекомбінантних ДНК плазміди як вектори



Скачати 177,78 Kb.
Дата конвертації07.06.2018
Розмір177,78 Kb.
ТипЛекція
Лекція 3. ПРИНЦИПИ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ. ТЕХНОЛОГІЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК
План лекції

1. Виникнення та розвиток генетичної інженерії

2. Технологія рекомбінантних ДНК

3. Плазміди як вектори

4. Генетична рекомбінація in vitro

5. Експресія в клітинах бактерій рекомбінантних ДНК
1. Поняття генетичної інженерії

Нині під генетичною інженерією розуміють систему експериментальних засобів, які дають змогу сконструювати лабораторним шляхом штучні генетичні структури у вигляді так званих рекомбінантних молекул ДНК. Суть генетичної інженерії полягає в переміщенні окремих генів з одного організму (клітини) в інший, що призводить до різних фенотипових змін організмів (клітин).

Сьогодні вчені можуть в умовах in vitro розрізати молекули ДНК у потрібному місці, ізолювати і очистити окремі її фраґменти, синтезувати їх з чотирьох дезоксирибонуклеотидів, можуть зшивати такі фраґменти. Техніка рекомбінантних ДНК, що лежить в основі генетичної інженерії, має велике значення не тільки для практики, але й значно розширює можливості пізнання фундаментальних основ організації й функціонування геномів. З моменту зародження генетична інженерія привертала увагу не тільки блискучими перспективами, а й потенційною небезпекою деяких досліджень.

Як правило, генетична інженерія здійснюється через ряд послідовних операцій:

- з’ясування локалізації гена (генів), що визначає прояв ознаки, що цікавить дослідника;

- підбір ферментів рестриктаз, які б “вирізали” потрібний ген (гени) з геному організму “донора”;

- підбір плазміди (вектора) для вмонтовування в неї потрібного гена (генів), вмонтовування, та “зшивання” генетичної інформації з використанням відповідних ферментів лігаз, отримання рекомбінантної молекули ДНК;

- клонування гена (генів) у плазміді (векторі);

- перенесення генетичної інформації в межах плазміди (вектора) в геном організму-“реципієнта”;

- дослідження експресії вмонтованої генетичної інформації в організмі-“реципієнті”.


2. Технологія рекомбінантних ДНК

Технологія рекомбінантних ДНК (молекулярне клонування, генна інженерія) – сукупність експериментальних процедур, які дозволяють проводити перенесення генетичного матеріалу (ДНК) з одного організму у другий.

Гена інженерія це конструювання in vitro функціонально активних генетичних структур тобто створення штучно генетичних програм.

Основне завдання прикладної генної інженерії – конструювання рекомбінантних ДНК, які можуть надати клітинам-реципієнтам здатність до синтезу таких речовин як гормони, інсулін, соматотропні, інтерферон, урокіназу та ін.



Приблизна схема отримання рекомбінантних ДНК (рис. 1):

1. З організму донора екстрагують нативну ДНК, з наступним ферментативним гідролізом (розрізають) та з’єднують (лігують) з іншою ДНК (клонуючим вектором), в результаті чого отримують рекомбінантну молекулу (конструкція «вектор-ДНК»).

2. Цю конструкцію вводять у клітину-господаря (реціпієнт), там вона реплікується та передається нащадкам. Цей процес називається трансформацією.

3. Ідентифікація та відбір клітин, які несуть рекомбінантну ДНК.

4. Синтез клітинами-господарями специфічного білкового продукту, що є підтвердженням клонування необхідного гену.



Рис. 1. Технологія рекомбінантних ДНК
3. Плазміди як вектори

Довгий час вважалося, що генетична конституція всіх клітин даного виду одинакова і не змінюється на протязі тривалого часу, проте, як виявилось, значна частина генетичних ознак, причому не тільки в бактерій, але й у вищих організмів, нестабільна (ці ознаки існують в одних клітинах чи штаммах і відсутні в інших, клітини можуть губити їх і придбати знову) і мобільна (може переноситись між клітинами чи переміщатися в одній і тій же клітині з одного локуса в інший). Така нестабільність пояснюється тим, що ці ознаки визначаються плазмідами і іншими атипічними генетичними системами.



Плазміди - це поза хромосомні дволанцюгові кільцеві молекули ДНК, які реплікуються автономно. Плазміди містяться у багатьох бактеріях.

Розрізняють плазміди:

- які несуть інформацію, щодо перенесення з клітини у клітину (F-плазміди);

- які несуть гени стійкості до антибіотиків (R-плазміди);

- які несуть гени, відповідальні за утилізацію незвичних метаболітів (плазміди деградації)

- які не мають гени, які виконують які не будь функції (критичні плазміди).

Всього плазмідної ДНК 0,1-5,0% сумарної клітинної ДНК.

Плазміди мають розміри від 1 до 500 т.п.н. Кожна з них несе сайт ініціації реплікації (ori), без якого плазміда не зможе реплікуватися у клітині.

Штамм, що містить плазміду, може давати початок варіантам, у яких плазміда втрачена; в подібних випадках плазміда губиться остаточно, клітина не може її регенерувати і може тільки получити із другої бактеріальної клітини.

Плазміди містять інформацію, необхідну для коньюгації бактеріальних клітин, ними обумовлений ряд захворювань рослин і тварин. Вони дозволяють клітинам використовувати багато складних сполучень в якості джерел живлення і забезпечують стійкість до різноманітних токсичних агентів, особливо до антибіотиків. Так, плазміди стафілококів несуть гени стійкості до пеніциліну, сполученням ртуті і ряду важких металів, які викликають летальний єфект (солями сурми, вісмута, кадмія і свинцю, іонам арсената і арсеніта). Гени стійкості до важких металів знайдені також в складі R-плазмід E.coli. Наявністю плазмід обумовлені також деякі захворювання з вираженою діареєю, стафілококовий імпедіго, створожування молока і перетворення його молочно-кислими бактеріями в сир, а також різноманітні біохімічні реакції, характерні для бактерій роду Pseudomonas. Плазміди можуть керувати синтезом інсектицида в клітинах Bacillus thuringiensis.

Кількість плазмід в клітині може коливатись від однієї до більше сотні; в цілому чим крупніша плазміда, тим менша кількість її копій в клітині. Зазвичай реплікація плазміди регулюється незалежно від реплікації хромосоми. Оскільки плазміди можуть розрізнятися по кількості копій в одній і тій самій клітині, то кількість копій має визначатися регуляторною системою, присутньою в самій плазміді. Сегмент ДНК довжиною не більше двух тисяч пар керує реплікацією плазміди, яка більше чим у 50 раз крупніша за нього.

При коньюгації бактеріальних клітин може проходити обмін плазмідами між бактеріями, що належать до різних видів і навіть родів, які не здатні обмінюватись генами, що находяться в хромосомах. Накінець, такий обмін може призводити до переносу генів, які знаходяться в плазміді, із одного виду в інший при спільному рості і конкуренції, в результаті чого реціпієнтні клітини набувають здатності виживати за рахунок донорних клітин. Ці властивості показують, що плазміди здатні до виживання незалежно від долі клітин, що їх утримують, вони не тільки не знижують загальної пристосованості клітини, але, навпаки, постачають її додатковими адаптивними функціями. Насправді, плазміди мають властивість включати в себе нові гени, а вже гени, що містяться в них “перетасовують” так, що це, з однієї сторони, не впливає на ефективність реплікації самих плазмід, а з іншої - наділяє клітину резервуаром генетичної інформації, яку вона при потребі використовує.

Другий метод, яким дослідники користуються для введення гена в бактеріальні клітини, оснований на застосуванні бактеріографа в якості вектора. Ген вбудовують в геном віруса (який містить 10-50 генів), і він реплікується разом із генами вірусу при розмноженні останнього в бактеріальній клітині.

Сам процес отримання вектору із плазміди проходить в декілька етапів:



1. Плазміду обробляють рестриктазою, яка розщепляє кільце плазміди лише в одному сайті одного з генів стійкості. Таким чином утворюється лінійна молекула з липкими кінцями.

2. Такі молекули змішують з попередньо обробленою рестриктазами донорною ДНК (яка містить необхідний ген). Така ДНК теж має липкі кінці.

3. Оскільки липкі кінці цих двох ДНК комплементарні, вони спарюються з утворенням гібридних молекул.

4. Потім суміш обробляють ДНК-лігазою фага Т4 у присутності АТР.

5. В результаті утворюються:

• різні комбінації фрагментів

• об’єднані фрагменти донорної ДНК

• об’єднані фрагменти плазмідної ДНК



5. Щоб зменшити кількість об’єднаних фрагментів плазмідної ДНК, рестрикційну ДНК обробляють лужною фосфатазою, яка відщеплює від лінеризованої молекули ДНК 5-фосфатні групи. ДНК-лігаза не може зшити дефосфорильовані кінці плазмідної ДНК.

6. Після реплікації у трансформованій клітині одноланцюгові розриви лігуються системою клітини-господаря.
4. Генетична рекомбінація in vitro

Генетична рекомбінація полягає в обміні генами між двома хромосомами. За визначення, яке дав Понтекорво в 1958р.,рекомбінація –це любий процес, що здатний привести до виникнення клітин або організмів з двома або більше спадковими детермінантами, за якими їхні батьки розрізнялись між собою і з’єднані між собою новим способом. Така рекомбінація обовязково відбувається у савців при утворенні статевих клітин. В процесі мейозу гомологічні хромосоми обмінюються генами (так званий кросенговер);саме ці обміни дозволяють пояснити перетасовку спадкових ознак у ряді поколінь. У вірусів і бактерій генетична рекомбінація відбувається рідше, ніж у тварин .Обмін генетичним матеріалом, за яким йде рекомбінація, відбувається між організмами одного і того ж чи близького видів. Всі живі організми володіють рестрикційними ендонуклеазами, які впізнають чужерідну ДНК, що проникла в організм, і розщеплюють її, таким чином зводячи до нуля генетичну рекомбінацію між еволюційно віддаленими геномами .

Обмін генами, рівно як і введення в клітину гена, що належить іншому виду, можна здійснити шляхом генетичної рекомбінації in vitro. Цей підхід був розроблений на бактеріях, а саме на кишковій палочці, в клітини якої вводили гени тварин і людини і домагалися їх реплікації .

Метод рекомбінації in vitro полягає у виділенні ДНК з різних видів, отриманні гібридних молекул ДНК і введенні рекомбінантних молекул в живі клітини з тим, щоб домогтись нової ознаки, наприклад синтезу специфічного білка.

Виділення генів, які являють собою сегменти ДНК, здійснюються на основі біохімічних методів ;складність виділення залежить від величини генома .Тоді як певний ген віруса виділити відносно просто, для гена людини це дуже складна задача .Тому дослідники застосовують непрямий митод, що полягає у виділенні інформаційної РНК (мРНК). В клітинах тварин транскрипція мРНК на ДНК відбувається в клітинному ядрі; молекули мРНК переносять інформацію з ядра в цитоплазму, де вона використовується при трансляції білків, амінокислотні послідовності яких закодовані в послідовностях нуклеотидів мДНК (в кінцевому результаті в ДНК). В клітинах бактерій (прокаріот), які не мають ядра, транскрипція і трансляція відбуваються одночасно і поєднанні; мРНК звязана з рибосомами, в яких відбувається з’єднання амінокислот з утворенням білків. Рибосоми грають ключову роль в трансляції і в клітинах тварин .

Поряд з інформацією про стуктуру білків (записаної за допомогою генетичного коду) молекула ДНК містить ряд регуляторних сигналів, записаних у вигляді специфічних нуклеотидних послідовностей. Ці сигнали є точками початку транскрипції чи трансляції, інші (а саме, між генами )вказують точки припинення зчитування генетичної інформації. Генетичний код, мабуть, універсальний для всіх живих організмів, іншими словами, дана послідовність ДНК обовязково кодує один і той самий білок в клітинах різних організмів, тоді як регуляторні сигнали в клітинах тварин і в бактеріальних клітинах не однакові. В клітинах тварин інформація про структуру білка може кодуватися не одною безперервною ділянкою ДНК, а декількома сегментами, розділеними ділянками ДНК, що носять назву інтронів. Інформаційна РНК, яка транскребується з ДНК, підлягає розщепленню, в результаті якого всі інтрони видаляються з її послідовності, а решта залишається фрагментами, або екзонами, з`єднуються разом з утворенням молекули мРНК, яка має послідовність, що кодуює послідовність амінокислот білка, а також містить ругуляторні сигнали, необхідні для початку і закінчення процесу трансляції.

Для експресії в бактеріальній клітині гена з клітини тварини необхідно, щоб в клітину була введена молекула ДНК з послідовністю нуклеотидів, що кодують білок, з якого інтрони вже видалені; іншими словами, потрібна молекула ДНК, синтизована на відповідній мРНК зворотньою транскриптазою. Більше того, регуляторні сигнали повинні бути схожі на відповідні бактеріальної клітини. Накінець, для отримання потрібного білка в достатній кількості бувають необхідні додаткові зміни бактеріальної клітини .
5. Експресія в клітинах бактерій рекомбінантних ДНК

Бактеріальна хромосома довжиною біля 1мм - це молекула ДНК, що складається приблизно із 3 млн. нуклеотидів; у клітині вона компактно укладена в декілька тисяч раз і займає простір менше 1 мкм в попереку. В клітинах людини ДНК організована в 46 хромосом, кожна із них містить молекулу ДНК довжиною біля 4см, а повне число нуклеотидів у ній наближується до 3млрд. Рестрикціонні ендонуклеази розщеплюють молекулу ДНК у відповідних точках, в результаті утворюються фрагменти з розмірами від декількох сотень до декількох тисяч нуклеотидів, їх можна розділити по різним довжинам. Відомо біля 400 ферментів рестрикції (рестриктаз), і кожний розщеплює ДНК спецефічним чином.

У дослідах по експресії генів в клітинах бактерій спочатку зі спеціалізованих клітин тварин, що утворюють специфічний білок (наприклад, інсулін), виділили мРНК, який кодує цей білок, потім за допомогою зворотньої транскриптази синтезували нитку ДНК, комплементарну мРНК. Другу нитку, комплементарну ДНК-копії, получали з використанням другого фермента – ДНК-полімерази. На слідуючому етапі двуниткову ДНК-копію встроювали в плазміду з використанням ферменту кінцевої трансферази, яка нарощує на кінцях ДНК коротку послідовність нуклеотидів (для утворення інсуліна Гілберт нарощував на ДНК послідовність із чотирьох нуклеотидів зі залишками цитозина). Плазміду розщеплювали на спецефічній ділянці рестрикціонною ендонуклеазою PstlI. Конкретною плазмідою, яку використовував Гілберт для одержання проінсуліну щура, була pBR322: ця плазміда характерна для клітин E.сoli і містить два гена, які визначають стійкість до пеніциліну і тетрацикліну; рестрикціонна ендонуклеаза розщеплює плазміду в середній частині гена, який кодуює пеніцилліназу. Після розщеплення плазміди на її кінці за допомогою кінцевої трансферази надбудовували послідовність із чотирьох нуклеотидів із залишками гуаніну. Після цього кінці двох одержаних молекул ДНК могли з’єднуватись через взаємодію комплементарних послідовностей нуклеотидів (гуаніна з цитозином); за допомогою бактеріального фермента – ДНК-лігази – здійснили зшивку ДНК-вставки і плазмідної ДНК. Утворена нова кільцева плазміда представляла собою вже молекулу рекомбінантної ДНК.

Зазвичай такі молекули рекомбінантних ДНК не проникають крізь кліткову стінку бактерій, проте розбавлений розчин хлористого кальцію робить клітини проникними, і деякі з них здобувають нову плазміду. Ці клітини можна відібрати, використовуючи генетичний маркер стійкості до антибіотику. Плазміда pBR322, використана в дослідах для здійснення синтезу інсуліна в бактеріальних клітинах, була розрізана в середній частині гена пеніциллінази; вбудований в плазміду фрагмент чужерідної ДНК порушував синтез цього фрагменту, проте ген, який забезпечує стійкість до тетрацикліну, залишається активним. Тому, якщо суспензію бактерій розмазували по поверхні живильного агара, який містить тетрациклін, кожна окрема клітина, що містить рекомбінантну ДНК і стійка до тетрацикліну, була здатна до ділення і утворення колонії, з якої можна одержати клон клітин, які містять чужорідну ДНК в складі рекомбінантної плазміди. Бактеріальні клітини цього клону синтезували б потрібний білок, структура якого закодована у введеному в них ДНК.

Труднощі в отриманні молекул рекомбінантних ДНК і досягненні їх повної експресії в бактеріальній клітині впершу чергу звязана звиділенням їх з клітин тварини потрібного гена – необхідної послідовності ДНК. Для дуже мілкого гена, який кодує дуже невеликий білок, базуючись на генетичному коді і знаючи послідовність амінокислот в цьому білку, вдається передбачити послідовність нуклеотидів, яку можна хімічно синтезувати. Ця задача була здійснена в Національному медичному центрі “Хоуп” (Дуарте, Каліфорнія) Ітакурою зі співробітниками. Вчені синтезували молекулу ДНК довжиною 42 нуклеотида, яка може кодувати соматостатин – гормон гіпоталамуса, що викликає пригнічення виділення інсуліну і гормону росту у людини. Молекули соматостатину складаються із 14 амінокислот. Синтез послідовності ДНК проводили, з’єднуючи тринуклеотиди; із 52 пар нуклеотидів синтетичного гена 42 пари складали структурний ген соматостатину, а інші нуклеотиди служили для приєднання синтетичного гена до плазміди pBR322, а також до сегменту лактозного оперона (lak) із генома E.coli.

Другий шлях подолання цієї трудності заключається у виділенні не ДНК(гена), а відповідної мРНК, якої зазвичай багато в клітинах, які спеціалізуються на синтезі певного білка; наприклад, мРНК інсуліна виявляється в в-клітинах островки Лангерганса в підшлунковій залозі, а мРНК гемоглобіна – в червоних кровяних клітинах. Ця мРНК не містить інтронів відповідних генів – інтрони вирізаються із неї за участі спеціальних ферментів, тому вона може транслюватися в бактеріальній клітині (гени останньої не мають інтронів). Зворотня транскриптаза може копіювати однониткову РНК із утворенням комплементарного ланцюга ДНК (цей фермент є у певних РНК-містящих вірусів, які у циклі розмноження здійснюють зворотню транскрипцію своєї РНК в ДНК). На однонитковій ДНК-копії за допомогою ДНК-полімерази синтезують комплементарний ланцюг ДНК; одержана в результаті дволанцюгова ДНК-копія відповідає гену, який потрібно було виділити, але при цьому із неї видалені всі інтрони. Істотно, проте, щоб синтезована таким чином ДНК-копія містила регуляторні сигнали, необхідні для її транскрипції і трансляції в бактеріальній клітині; ці сигнали в бактеріальних клітинах і в клітинах тварин відрізняються. Один із них служить сигналом початку синтеза мРНК з утворенням білка; є також сигнали про закінчення транскрипції і трансляції.

Чужорідну ДНК можна вбудовувати безпосередньо за бактеріальним геном чи в середині його після розщеплення ДНК рестрикціонною ендонуклеазою; це роблять, щоб уникати труднощів, зв’язаних з ініціацією транскрипції і трансляції чужерідної ДНК. В результаті утворюється гібридний білок, в якому послідовність амінокислот чужерідного білка оточена послідовностями бактеріального білка. Синтетичний ген соматостатина був вбудований в плазміду pBR322 E.coli близько до кінця гена, кодуючого в-галактозидазу; між двома генами був поміщений кодон метіоніну. Після введення рекомбінантної плазміди в бактеріальну клітину кишкова паличка стала синтезувати гібридний білок; частину його, яка являє собою соматостатин, відщеплювали потім від в-галактозідази обробкою бромціаном, який розриває білковий ланцюг по залишку метіоніну. Такий складний спосіб одержання гормону був необхідний, оскільки соматостатин, синтезований у вигляді вільних молекул, швидко деградує під дією бактеріальних протеаз.

Чужерідну ДНК можна вбудовувати також в ген бактеріального білка, що секретується в нормі крізь кліткову стінку назовні; в цьому випадку необхідність екстракції білка із клітини відпадає, оскільки білок виділяється на зовнішнє середовище.




Каталог: data -> users
users -> Тема. Метод архітектурної біоніки. Біотектонічне моделювання Мета
users -> Лекція №2 Тема морально-етичний закон християнства декалог (десять заповідей божих) Мета лекції
users -> Лекція. Лекція №1 Тема. Тема лекції. Фактори, що враховуються при відборі дітей для занять хореографією. Мета
users -> Лекція Тема Використання новітніх технологій навчання природознавства в початковій школі Мета
users -> Положення народознавчої роботи у сучасному українському днз мета заняття: поглибити знання студентів про особливості народознавчої роботи в умовах сучасного дошкільного навчального закладу. Питання для обговорення
users -> Історія української етнографії (електронний збірник статей І матеріалів)
users -> Лекція №3 Тема № святі тайни в християнстві мета лекції
users -> Тема Політична влада Мета заняття: з’ясувати поняття «влада», «політична влада»
users -> Лекція №14 Тема. Поняття про транспорт, лісові дороги та їх технічні елементи. Класифікація лісових доріг
users -> Тема історичні знання україни-руси в IX – XIII ст. Початки літописання в Руси-Україні IX – X ст. «Повість врєменних літ»


Поділіться з Вашими друзьями:


База даних захищена авторським правом ©uchika.in.ua 2019
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка