Реферат «Розробка та впровадження у виробництво діагностичних тест-систем для визначення гмо в харчовій продукції та сільськогосподарській сировині рослинного походження»



Сторінка2/2
Дата конвертації09.11.2017
Розмір0.54 Mb.
ТипРеферат
1   2

Рис. 2. Схема підходів та типів ДНК-мішеней, що були використані при розробці серії тест-систем. Вказано різні рівні специфічності визначення послідовностей ГМ-конструктів.
При розробці панелі скринінгових тест-систем (табл. 1) в якості мішеней ми обрали як регуляторні елементи, так і послідовності введених генів нової ознаки. Оскільки в Україні ріпак, будучи третьою олійною культурою після соняшника та сої за площею посівів і валовим збором, більш ніж 90% врожаю якого реалізується на зовнішніх ринках, то є постійна необхідність в його перевірці щодо вмісту ГМО. На жаль, проведення скринінгових досліджень ріпаку лише на присутність регуляторних елементів (p35S, tNOS), які широко використовуються в генній інженерії, виявилось малоефективним. Дана культура є вразливою на вірус мозаїки цвітної капусти (CaMV), який несе в собі природний промотор p35S.
Таблиця 1. Панель тест-систем для проведення скринінгового аналізу на ГМО.

Назва тест-системи

Назва тест-системи


1

ГМО соя (p35S/tNOS скринінг)


4

ГМО (p35S/tNOS скринінг)

2


ГМО кукурудза (p35S/tNOS скринінг)

5

ГМО рослина-1 (p35S/tNOS скринінг)

3


ГМ ріпак (CP4epsps/Pat/Bar/tNOS скринінг)

6

ГМО рослина-2 (CP4epsps /Pat/Bar/tNOS скринінг)

Нами було запропоновано проводити дослідження ріпаку також за генами нових ознак - 5-енолпірувілшикимат-3-фосфат синтази (epsps) із Agrobacterіum tumefacіens штаму CP4, фосфінотрицин N-ацетилтрасферази із Streptomyces viridochromogenes (pat), фосфінотрицин N-ацетилтрасферази із Streptomyces hygroscopicus (bar). Олігонуклеотидні праймери, підібрані для проведення ПЛР, локалізувалися або в самому гені нової ознаки або в різних елементах генно-інженерного конструкту (рис. 3).


Рис. 3. Схема скринінгової панелі мультиплексних ПЛР-РЧ тест-систем для визначення ГМО в сої, кукурудзі та ріпаку.


Запропонована нами панель тест-систем для ідентифікації певних біотехнологічних ліній рослин орієнтована на визначення трансформаційних подій. Кожна тест-система виконана в форматі мультиплексу і дозволяє одночасно проводити дві незалежні ПЛР. Одна реакція направлена на виявлення відповідної трансформаційної події, інша виступає в якості внутрішнього ендогенного контролю проходження ампліфікації. Загальна кількість становить 36 тест-систем (табл. 2). За допомогою запропонованих тест-систем можливо виявляти 5 ліній біотехнологічної сої, 17 ліній кукурудзи, 6 ліній ріпаку, 2 лінії картоплі, 1 лінію рису, 1 лінію цукрового буряку. Також до цієї панелі входять діагностикуми, які дозволяють здійснювати видову ідентифікацію рослинних компонентів, що входять до складу готової харчової продукції та виявляти такі рослини як сою, кукурудзу, ріпак, пшеницю, рис, томати, картоплю та цукровий буряк. Для запобігання отримання хибно-позитивних результатів при проведенні скринінгових аналізів за регуляторними елементами було запропоновано тест-систему для ідентифікації природного вірусу CaMV та бактерії Agrobacterium tumefaciens.

Панель тест-систем на кількісний вміст ГМО розроблялась таким чином, щоб забезпечити можливість визначення % ГМО як за регуляторними елементами, так і трансформаційними подіями. Всього було розроблено 13 тест-систем для проведення кількісного аналізу (табл. 3). Кількісна оцінка вмісту ГМО у досліджуваному зразку базується на побудові калібрувальної кривої за значеннями стандартних зразків. Запропоновані нами тест-системи комплектуються сертифікованим референтним матеріалом, розробленим Бельгійським інститутом контрольних матеріалів і методів (Institute for Reference Materials and Measurements, ІRMM) та американською асоціацією хіміків нафтохімічної та масложирової промисловості (The American Oil Chemists' Society, AOCS).


Таблиця 2. Панель тест-систем для ідентифікації ліній ГМ рослин та видової ідентифікації сільськогосподарських культур, вірусів та бактерій.

Назва тест-системи

Назва тест-системи


виконання - ідентифікація ГМ сої

1

Соя лінія GTS40-3-2


4

Соя лінія DP356043

2


Соя лінія MON89788

5

Соя лінія A5547-127

3


Соя лінія A2704-12

виконання - ідентифікація ГМ кукурудзи

1

Кукурудза лінія MON810

10

Кукурудза лінія MON87460

2

Кукурудза лінія MON863

11

Кукурудза лінія MON88017

3

Кукурудза лінія BT176

12

Кукурудза лінія MON89034

4

Кукурудза лінія BT11

13

Кукурудза лінія DAS-59122-7

5

Кукурудза лінія GA21

14

Кукурудза лінія 3272

6

Кукурудза лінія NK603

15

Кукурудза лінія MIR 162

7

Кукурудза лінія T25

16

Кукурудза лінія LY038

8

Кукурудза лінія MIR604

17

Кукурудза лінія 98140

9

Кукурудза лінія T1507

виконання - ідентифікація ГМ ріпаку

1

Ріпак лінія MS1,RF1

4

Ріпак лінія RT73

2

Ріпак лінія MS1,RF2

5

Ріпак лінія T45, HCN28

3

Ріпак лінія MS8,RF3

6

Ріпак лінія HCN92

виконання - ідентифікація інших ГМ культур

1

Картопля лінія AM04-1020

3

Рис лінія LLRICE62

2

Картопля лінія EH92-527-1

4

Цукровий буряк лінія Н7-1

виконання - ідентифікація видова рослин

1

Соя/томати/картопля

3

Ріпак/цукровий буряк

2

Кукурудза/рис/пшениця

4

Вірус CaMV / бактерія Agrobacterium tumefaciens

Праймери та зонди для проведення ПЛР у реальному часі підбиралися за допомогою комп’ютерної програми Primer Express 3.0 (Applied Biosystems) або відбиралися з бази даних Європейської референтної лабораторії з визначення ГМО (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed, JRC). Зонди, специфічні до послідовностей генно-інженерних конструктів та природних організмів, були мічені флюоресційними барвниками FAM, ROX, HEX, Cy5 та гасниками флюоресценції BHQ1, BHQ2, BHQ3. Оптимізацію умов ампліфікації проводили за такими параметрами, як температура гібридизації праймерів, концентрація MgCl2, концентрація та співвідношення праймерів і зондів. Оцінювання ефективності роботи тест-системи за такими метрологічними характеристиками як специфічність, чутливість, межа детектування, повторюваність та відтворюваність результатів аналізу проводилась відповідно до вимог JRC (ЕС) з використанням сертифікованих референтних зразків ІRMM (ЕС) та AOCS (США). Межа чутливості тест-систем становить від 10 до 50 копій ДНК-мішені, що відповідає вимогам ДСТУ ISO 21570:2008. Межа кількісного визначення відповідає найменшому стандартному зразку та становить 0,1%.


Таблиця 3. Панель розроблених тест-систем для кількісного визначення ГМО.

Назва тест-системи

Назва тест-системи


Виконання ідентифікація ГМ сої

1

ГМО соя (р35S кількість)

8

Кукурудза лінія MON810 (ГМ кількість)

2


ГМО кукурудза (р35S кількість)

9

Кукурудза лінія MON863 (ГМ кількість)

3


ГМО кукурудза (tNOS кількість)

10

Кукурудза лінія MIR604 (ГМ кількість)

4

Соя лінія GTS40-3-2 (ГМ кількість)

11

Кукурудза лінія BT176 (ГМ кількість)

5

Кукурудза лінія BT11 (ГМ кількість)

12

Кукурудза лінія NK603 (ГМ кількість)

6

Кукурудза лінія GA21 (ГМ кількість)

13

Кукурудза лінія T1507 (ГМ кількість)

7

Кукурудза лінія T25 (ГМ кількість)

В процесі розробки і виробництва було проведено серію порівняльних випробувань з аналогічними тест-системами інших виробників, зокрема тест-системами Applied Biosystems™ (США), НПК «Синтол» та «ДНК-Технология» (Росія). За всіма досліджуваними показниками тест-системи виробництва ДП «Укрметртестстандарт» не поступалися іншим виробникам, а за спектром запропонованих мішеней їх значно перевершували. Контроль якості тест-систем та оцінку достовірності результатів випробувань харчової продукції і сільськогосподарської сировини здійснювали шляхом успішної участі в міжнародних раундах порівняльних випробувань: FAPAS®GeMMA Scheme (Великобританія), EU-RL GMFF (Італія), КООМЕТ (РФ), протягом 2007-2015 років. Працездатність та надійність тест-систем було перевірено протягом останніх 5-и років випробувальною лабораторією ДП «Укрметртестстандарт» та іншими лабораторіями країни.

Розроблена серія тест-систем є апробованою для роботи на більшості приладів, якими оснащено випробувальні лабораторії країни, а саме IQ-5 (Bio-Rad, Франція); CFX-96 (Bio-Rad, США); АНК-32 (Сінтол, РФ); ДТ-96, ДТ-32 (ДНК-Технологія, РФ); 7000, 7300, 7500 (Applied Biosystems, CША); 6000 (RotorGen, Австралія). Протокол проведення ПЛР є універсальним для тест-систем всієї серії, що дозволяє досліджувати зразки на декілька різних показників одночасно.

Таким чином, все вищезазначене свідчить про створення та впровадження у виробничий цикл першого вітчизняного діагностикуму з визначення ГМО в харчовій продукції та сільськогосподарській сировині рослинного походження методом ПЛР у реальному часі. Розроблена серія тест-систем є сучасною, високочутливою, конкурентоспроможною і найголовніше - не поступається за своїми метрологічними характеристиками закордонним аналогам. Наші тест-системи успішно використовуються близько тридцятьма акредитованими за ДСТУ ISO/ІЕС 17025 лабораторіями України різних систем підпорядкування. Завдяки виробництву тест-систем успішно виконується стратегічно важлива для України робота з контролю якості зернової продукції та продовольчої сировини рослинного походження, що йде як на внутрішній ринок, так і експортується у країни ЄС, Ближнього та Середнього Сходу.

Будівництво потужностей під виробництво тест-систем на базі ДП «Укрметртестстандарт» було розпочато у 2010 році. Загальні капітальні вкладення в технологію та обладнання склали 195 тис грн, у тому числі 170,3 тис грн у першій рік реалізації проекту. Витрати на підготовку виробництва - ще 51 тис грн. Прибуток від продажу готової продукції за весь період реалізації склав 2 200,9 тис грн при середній ціні одиниці продукції в 3 764,2 грн. Розрахунки економічної ефективності створення технології виробництва тест-систем показали наступне. Індекс дохідності (ІД) дорівнює 16,8%. Тобто, рентабельність реалізації проекту становить 16,8 відсотків, а проект слід визначити прибутковим. Витрати на проект приблизно мають бути окупленими за шість років (Т=5,9). Точка беззбитковості проекту знаходиться в межах 75 відсотків номінального обсягу виробництва, що підтверджує надійність проекту.

На сьогоднішній день ринок тест-систем для in vitro діагностики в Україні представлено виробами виключно іноземного виробництва. Серія тест-систем виробництва ДП «Укрметртестстандарт» є чи не єдиним національним продуктом, який дозволяє визначати ГМО в харчовій продукції та сільськогосподарській сировині. У таблиці 4 наведено дані щодо цінової політики виробів ДП «Укрметртестсандарт». Представлені дані дуже добре демонструють, що тест-системи вітчизняного виробництва у 2,2 та 4 рази дешевші діагностикумів виробництва РФ та ЄС, відповідно. Середню вартість одиниці продукції виводили за цінами подібних між собою тест-систем.


Таблиця 4. Виробники тест-систем для визначення ГМО та середня вартість одиниці продукції у грн. за цінами 2016 року.

Назва

ДП“Укрметртестстандарт”

(Україна)

ЗАТ“Синтол” (РФ)

R-Biopharm (Німеччина)

Тест-системи для визначення ГМО

3 601,70

7950,17

14601,46


За результатами проведеної роботи опубліковано 2 монрграфії, 5 посібників та 10 статей. наукових праць у фахових виданнях України. Роботу було представлено на 19 міжнародних наукових конференціях. За результатами проведених досліджень підготовлено до захисту 1 докторську дисертацію.

Автори:


Облап Руслан Васильович

к.б.н., с.н.с., старший науковий співробітник науково-виробничої лабораторії молекулярно-генетичних досліджень ДП «Укрметртестстандарт»;




Новак Ніна Богданівна

к.с.-г.н., науковий співробітник науково-виробничої лабораторії молекулярно-генетичних досліджень ДП «Укрметртестстандарт»;




Голубець Руслан Анатолійович

к.в.н., начальник науково-виробничої лабораторії молекулярно-генетичних досліджень ДП «Укрметртестстандарт»;






Каталог: sites -> default -> files
files -> Положення про порядок підготовки фахівців ступенів доктора філософії та доктора наук в аспірантурі (ад’юнктурі) та докторантурі вищих навчальних закладів
files -> Відділ аспірантури та докторантури Уманського державного педагогічного університету імені Павла Тичини
files -> Київський національний університет імені Тараса Шевченка
files -> Програма вступного іспиту до аспірантури зі спеціальності 22. 00. 03 соціальні структури та соціальні відносини Затверджено
files -> Культура Античності. Культура Давньої Греції
files -> Системотехнічні засади та інструментально-програмні засоби створення та підтримки цифрових словників сидорчук надія Миколаївна
files -> Міністерство освіти І науки україни державний економіко-технологічний університет транспорту
files -> Конспект лекцій для студентів усіх спеціальностей освітньо-кваліфікаційних рівнів «спеціаліст»,
files -> Конструкції для енергоефективного відновлення забудови, постраждалої від надзвичайних ситуацій


Поділіться з Вашими друзьями:
1   2




База даних захищена авторським правом ©uchika.in.ua 2020
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка