Як одержати



Сторінка11/14
Дата конвертації16.03.2017
Розмір2.54 Mb.
1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   14
Оцінювання рівня техніки

днак, після закінчення синтезу захисну групу треба було видаляти і для введення й видалення даної захисної групи потрібні були операційно складні органічні реакції та значна кількість дорогих і шкідливих реагентів, що з погляду практичної застосовності, економічної ефективності, захисту навколишнього середовища тощо створює значні труднощі для виконання цього відомого методу. Відповідно, існує попит на метод хімічного синтезування олігонуклеотиду з аміногрупи незахищеного нуклеозиду фосфороамідиту як одного цілого і метод Letsinger et al., як показано на наступній схемі хімічної реакції, відомий як піонерський метод (Nucleic Acid Research, 20:1879-1882, 1992):


Однак, метод Letsinger et al. не є практичним, універсальним і не використовується на практиці, оскільки існують наступні недоліки:


  1. конденсаційний вихід на кожній стадії є низьким (приблизно 97%: для синтезу 50-mer або більше довголанцюжного олігонуклеотиду, необхідний вихід щонайменше 99%) і промисловий автоматичний синтезатор ДНК не може використовуватись для цього методу, тому довголанцюжний олігонуклеотид, який містить від 50 до 100 нуклеотидів, зазвичай необхідних для хімічного синтезу ДНК тощо, не може бути синтезованим;




  1. можуть бути використані тільки високореактивні, специфічні нуклеозидфосфороамідити, і тому цей метод має обмежену сферу застосування і не є практичним; та




  1. пиридин гідрохлорид, використовуваний як каталізатор, є нестійкою сполукою з дуже високою вологонепроникністю, й тому працювати з нею важко.

Короткий виклад винаходу


Д
R.42 Рішення технічної проблеми

аний винахід було створено з урахуванням наведеного вище рівня техніки, і метою даного винаходу є надання практичного методу, здатного легше і надійніше здійснювати хімічне синтезування 100-mer або більшого довголанцюжного олігонуклеотиду, а також нової сполуки, що використовується в даному методі.


Для вирішення цієї проблеми в даному винаході надається метод хімічного синтезу олігонуклеотиду фосфороамідитним методом, який включає одержання основи незахищеного нуклеозидфосфороамідиту з основи групи незахищеного нуклеозиду шляхом використання імідазол фторсульфонату, представленого наступною хімічною формулою, і спарювання даної основи незахищеного нуклеозидфосфороамідиту в установленому порядку в присутності даного імідазолфторосульфонату для хімічного синтезу олігонуклеотиду, що складається із певної послідовності нуклеотидів.

У кращому втіленні методу згідно з даним винаходом, спарена основа незахищеного нуклеозидфосфороамідиту обробляється розчином бензімідазолфтороформсульфонатом.


Т
Переваги винаходу

обто, винахідники ґрунтувались на тому, що основа незахищеного нуклеозидфоссфороамідиту, приготовлена з використанням сполуки імідазолфтороформсульфонат (далі імідазолтріфлат) замість зазвичай використовуваного тетразолу в якості каталізатора для реакції конденсування між нуклеозидфосфороамідитом та нуклеотидом не має побічної реакції на аміногрупу в основі групи нуклеотиду, і в результаті цього вони виявили, що ускладнені процедури, такі як, наприклад, введення і вилучення захисної групи, непотрібні, а також що синтез може проводиться промисловим синтезатором, таким чином доповнюючи цей винахід. Крім того, винахідники виявили, що побічна реакція на аміногрупу в основі може бути повністю інгібована шляхом обробки вищеописаної спареної основи незахищеного нуклеозидфосфороамідиту з метаноловим розчином бензимідазол фтороформальфонату (далі бензимідазол тріфлат), внаслідок чого синтезується більш бездоганний олігонуклеотид, і даний винахід був таким чином завершений.


Короткий опис креслень


R.42(1)(d)

Короткий опис креслень

На Фіг. 1 представлено схематичне зображення кожної стадії реакції методом даного винаходу;


На Фіг. 2 схематичне зображення кожної стадії реакції методом даного винаходу, коли проводилось обробляння амонієм;
На Фіг.3 зображено HPLС-профіль фрагментів ДНКDNA, синтезованих методом даного винаходу.
Детальний опис винаходу
Д
R.42(1)(е)

Опис щонайменше одного способу виконання винаходу з посиланням на креслення


алі детально описується найкращій спосіб виконання даного винаходу.
Імідазол тріфлат згідно з даним винаходом може одержуватись шляхом змішування імідазолу з фтороформсульфоновою кислотою в пропорції 1:1 в діхлорметані, як показано нижче в прикладі його приготування в Прикладі 1.
Отриманий таким чином імідазоліум тріфлат не поглинає вологу, що також показано в Прикладі 1, і є дуже стійким в звичайних умовах використання, тому він легко обробляється.
У методі хімічного синтезу згідно з даним винаходом основа незахищеного нуклеозидфосфороамідиту одержується з основи незахищеного нуклеотиду з використанням імідазол тріфлату згідно з описаним вище, і ця основа незахищеного нуклеозидфосфороамідиту використовується як одне ціле і кожний нуклеозидфосфороамідит спарюється у встановленому порядку, хімічно синтезуючи таким чином олігонуклеотид, який складається з певної послідовності нуклеотидів.
Основа незахищеного нуклеозидфосфороамідиту готується шляхом реакції основи незахищеного нуклеозидфосфороамідиту з цианоетил-біс-амідитом у присутності імідазол тріфлата як каталізатора, як показано, наприклад, у Прикладі 2 нижче. У цьому випадку реакція відбувається вибірково на гідроокисній групі в сахарній частині нуклеозиду, тому чотири види N - незахищених нуклеозидфосфороамідитів, використаних у синтезі ДНК, а саме, дезоксиаденозин, дезоксимідин, дезоксигуанозин та тимідин фосфороамідит можна отримати кількісно.
Отримані таким чином чотири види N - незахищених нуклеозид фосфороамідититів використовуються як одиниці для синтезу олігонуклеотиду, що складається із бажаної послідовності нуклеотидів, шляхом способу твердофазного синтезу тощо, відомого із рівня техніки. Крім того, ця синтетична реакція може бути також проведена способом у промисловому синтезаторі ДНК згідно з його протоколом.
У способі даного винаходу кожний спарений N – незахищений нуклеозидфосфороамідит піддається після кожного спарювання обробці розчином бензимідазол тріфлату (наприклад етаноловим розчином). Шляхом цієї обробки побічна реакція на аміногрупу в основі групи є повністю інгібованою і, таким чином, синтезується більш бездоганний олігонуклеотид.
Бензимідазол тріфлат можна синтезувати за наступною схемою реакції:


Приклади
Даний винахід описується далі більш детально, а саме з посиланням на Приклади, які, однак, не призначені для обмеження даного винаходу.
Приклад 1: Приготування імідазол тріфлату
Імідазол і фтороформсульфонова кислота були змішані в пропорції 1:1 в діхлорметані і взаємодіяли при 25°С 10 хвилин, як показано нижче на схемі реакції, внаслідок чого було приготовлено імідазол трифлат згідно з даним винаходом.

В результаті аналізу стандартними способами, отриманий імідазол трифлат мав характеристики, наведені в Таблиці 1


Таблиця 1

Безколірний кристал

Точка плавлення: 197-198 °С

Аналіз за елементами

Теоретичний: C4H5F3N2O3S: C, 22.02;H,2.31; N,12.84

Виявлено: С, 21.96; Н, 2.30; N, 12.74

Не має вологостійкості



Приклад 2: приготування основи групи незахищеного нуклеозидфосфороамідиту



Імідазолтрифлат, отриманий у Прикладі 1, було використано як каталізатор таким чином, щоб основа групи незахищеного нуклеозиду вступила в реакцію з цианоетил-біс-амідитом, як показано на наступній схемі реакції:

Шляхом цієї реакції були відповідно одержані чотири види N - незахищених нуклеозидфосфороамідититів, наведені в Таблиці 2, а саме, дезоксиаденозин, дезоксимідин, дезоксигуанозин та тимідин фосфороамідит. Як також показано в Таблиці 2, відповідні нуклеозидфосфороамідити були одержані майже кількісно.



Приклад 3: Синтез фрагменту ДНК
60-mer фрагмент ДНК, що містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:1 було синтезовано шляхом методу твердофазного синтезу з використанням комерційного синтезатора DNA з 4 видів N - незахищених нуклеозидфосфороамідитів, як одиниць, отриманих в Прикладі 2. Цикл реакції був таким, як показано в Таблиці 3.
Таблиця 3

Стадія

Дія

Реагент(и)

час, хв..

1

промивання

СН3СN

0.50

2

дитрилірування

3%ССІ3СООН/СН2СН2

1.0х3

3

промивання

СН3СN

2.0

4

спарювання

01 М амідит/ СН3СN+0.1МІМТ/ СН3СN

0.25

5

очікування




1.0

6

N-Р розщеплення

0.3 M BIT/ СН3СN

0.50

7

очікування




2.0

8

промивання

СН3СN

0.50

9

окислення

1 Mt-C4H9OOH/CH2CI2

0.25

10

очікування




1.0

BIT-бензимідазоліум трифлат; ІМТ- імідазоліум трифлат

У цій синтетичній реакції кожна стадія (реакція конденсації) витягування ланцюга, наведеного в Таблиці 1, відбувається при майже 100% виході, і частково захищений 60-mer олігонуклеотид фосфат було отримано зазвичай при 100% виході. Цей вихід був дуже високим, враховуючи, що вихід 60-mer олігонуклеотиду, проведений звичайними методами, як правило, становить близько 20-40%.

Крім того, як показано на фіг.2, зняття захисних груп і видалення шляхом обробки розчином амонію (25°С, 60 хвилин) призвело до отримання незахищеного 60-mer DNA в кількісному виході.

Аналіз отриманої необробленої незахищеної 60-mer ДНК шляхом високопродуктивної рідинної хроматографії в умовах, показаних у таблиці 4, показав, що її чистота становила 95% або більше, як показано на фіг.3.


Таблиця 4

Аналітичні умови

Колонка

DEAE-2.5m(250 mm)

Швидкість потоку

0.5 мл/хв..

Температура

25°С

Елюєнт А

20 мМ Tris-HCI (pH 9.0)

В

A + 1 M NaCI

Градієнт

A:B (100:0)→(50:50) лінійний градієнт

Як детально описано вище, метод синтезування олігонуклеотидів шляхом використання такого імідазолтріфлату має наступні переваги:




  1. вихід конденсації на кожній стадії становить майже 100% і даний метод може також застосовуватись з автоматичним синтезатором просто шляхом зміни програми для синтезу і використаних реагентів. Тому синтез довголанцюжного олігонуклеотиду, що містить від 50 до 100 нуклеотидів, зазвичай необхідних для хімічного синтезу ДНК тощо, є можливим з 1/10 або меншими витратами у порівнянні із звичайними методами;

  2. завдяки можливості використання невизначених нуклеотидфосфороамідитів, даний метод має широкий спектр застосування і є практичним; та

  3. імідазол тріфлат згідно з даним винаходом, використаний як каталізатор, є стійкою сполукою, яка не абсорбує вологу, тому його дуже легко застосовувати в звичайних умовах.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

SEQ ID:1 №:1

ДОВЖИНА: 60 основ

ТИП: нуклеїнова кислота

СКРУЧЕНІСТЬ: одна

ТОПОЛОГІЯ: лінійна

МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: синтетична ДНК

ПОСЛІДОВНІСТЬ:
TATGGGCCTT TTGATAGGAT GCTCACCGAG CAAAACCAAG AACAACCAGG AGATTTTATT 60
Формула винаходу


R. 43(1)(а)

Незалежний пункт формули

1. Спосіб хімічного синтезу олігонуклеотидів фосфороамідитним методом, який включає приготування основи незахищеного нуклеозидфосфороамідиту з основи незахищеного нуклеозиду шляхом використання імадазолфтороформсульфонату, представленого наступною хімічною формулою, та спарювання даної основи незахищеної групи нуклеотид фосфороамідиту в установленому порядку в присутності імадазолфтороформсульфонату для хімічного синтезу олігонуклеотиду, що містить певну послідовність нуклеотидів.



2
R. 43(3),(4)

Залежний пункт формули

. Спосіб за п.1, в якому спарена основа незахищеного нуклеозидфосфороамідиту обробляється розчином бензимідазолфтороформсульфонату.


Р
Art..85
еферат

R.47(1)

Назва винаходу

Спосіб хімічного синтезу олігонуклеотидів

Д
R.47(2, (3), (5)

Зміст реферату

аний винахід подає практичний спосіб, здатний легко і з більшою надійністю здійснювати хімічне синтезування 100-mer або більш довголанцюжного олігонуклеотиду, а також нову сполуку, використану в даному способі. Даний винахід стосується способу хімічного синтезу олігонуклеотиду фосфороамідитним методом, який включає приготування незахищеної основи нуклеосидфосфороамідиту з незахищеної основи нуклеозиду шляхом використання імадазолфтороформсульфонату, представленого наступною хімічною формулою, та спарювання незахищеної основи нуклеотидфосфороамідиту в установленому порядку для хімічного синтезу олігонуклеотиду, який складається з певної послідовності нуклеотидів. Винахід також стосується імідазолфтороформсульфонату, представленому хімічною формулою.







Каталог: i upload -> file
file -> Перелік зарубіжних баз даних об’єктів промислової власності, до яких надається безоплатний доступ в Інтернеті
file -> П ерелік патентної документації на cd-rom та dvd, наявної у фгк
file -> П ерелік патентної документації на cd-rom та dvd, наявної у фгк
file -> Державна службаінтелектуальноївласностіукраїн и
file -> Міністерствоосвітиінаукиукраїн и державний департамент інтелектуальної власності
file -> Державна службаінтелектуальноївласностіукраїн и
file -> Перелік адрес зарубіжних баз даних об’єктів промислової власності, до яких надається безоплатний доступ в Інтернеті
file -> Перелік адрес зарубіжних баз даних об’єктів промислової власності, до яких надається безоплатний доступ в Інтернеті
file -> П ерелік патентної документації на cd-rom та dvd, наявної у фгк
file -> Аналіз промислової стратегії підприємства


Поділіться з Вашими друзьями:
1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   14


База даних захищена авторським правом ©uchika.in.ua 2019
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка